NARİNGENİNİN SİSPLATİN OTOTOKSİSİTESİNE KARŞI ETKİSİNİN HAYVAN MODELİNDE DEĞERLENDİRİLMESİ

Özet

Gereç ve yöntemler: Otuz iki erkek sıçan, her biri sekiz sıçan olmak üzere 4 gruba (kontrol, sisplatin, naringenin + cisplatin ve naringenin) ayrıldı. Her iki kulaktan distorsiyon ürünü otoakustik emisyon (DPOAE) ve işitsel beyin sapı yanıtı (ABR) testleri tüm gruplarda çalışmanın başında ve 6. günde yapıldı. Biyokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi için 6. günde intrakardiyak kan örnekleri alındı.

Bulgular: Odyolojik değerlendirmede, grup 2' de (sisplatin), diğer gruplarla karşılaştırıldığında 6. günde DPOAE değerlerinde anlamlı düşüşler ve ABR eşiklerinde anlamlı artışlar vardı. Grup 1 (kontrol), 3 (naringenin + cisplatin) ve 4' te (naringenin) tedavi öncesi ve sonrası DPOAE ve ABR sonuçları arasında anlamlı bir fark yoktu. Biyokimyasal analizlerde toplam oksidan durumu (TOS) değeri grup 2' de (cisplatin) diğer gruplara göre anlamlı olarak daha yüksekti. Toplam antioksidan durumu (TAS) değeri grup 3' te (naringenin + sisplatin) grup 2' ye göre anlamlı olarak yüksekti.

Sonuç: Odyolojik testler ve biyokimyasal, naringeninin antioksidan düzeylerini artırarak ve oksidatif stres parametrelerini azaltarak sisplatin ototoksisitesine karşı koruyucu etkisi olabileceğini ortaya koymuştur.

Giriş

Sisplatin, akciğer, baş-boyun, yumurtalık ve mesane kanserlerinin tedavisinde sıklıkla kullanılan etkili bir antineoplastik ilaçtır. Sisplatin antikanser etkisini deoksiribonükleik asit sentezini inhibe ederek ve reaktif oksijen radikallerinin seviyesini artırarak gösterir. Ek olarak, mitokondriyal hasarın bir nedeni olan hücre içi glutatyonun azalmasına yol açar ve bu da lipid peroksidasyonuna neden olur [8]. Bununla birlikte, sisplatinin nefrotoksisite, ototoksisite, nörotoksisite ve kemik iliği toksisitesi gibi doza bağlı yan etkileri vardır. Sisplatin tedavisinden saatler veya günler sonra kendini gösterebilen ototoksisite için şu anda rutin bir tedavi yöntemi mevcut değildir [9]. Sisplatin kaynaklı ototoksisite, başta yüksek frekanslarda olmak üzere tüm frekanslarda bilateral, progresif ve geri dönüşümsüz sensörinöral işitme kaybı şeklinde gelişir [10].

Sisplatin ototoksisitesinin hücresel ve moleküler mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Sisplatinin, Corti'nin organı, stria vaskülaris, spiral bağ ve spiral ganglionik hücrelerde aşırı miktarda serbest oksijen radikal üretimine neden olarak koklea ve dış saç hücrelerinde (OHC'ler) oksidatif hasara ve apoptoza [11] yol açtığı belirtilmiştir. Ayrıca sisplatin, kokleadaki antioksidan enzimleri azaltır. Lipoik asit, resveratrol, kurkumin ve Gingko biloba ekstresi gibi antioksidan ajanların sisplatinin ototoksisitesine karşı koruyucu etkisini inceleyen bir dizi çalışma yayınlanmıştır [12-14].

Naringenin tedavisinin sıçanlarda sisplatin kaynaklı nefrotoksisite, hepatotoksisite ve genotoksisiteye karşı önemli ölçüde koruduğu da gösterilmiştir [15]. Bununla birlikte, naringenin'in sisplatin ile indüklenen ototoksisite üzerindeki potansiyel koruyucu etkisi araştırılmamıştır.

Bu çalışmanın amacı naringeninin sisplatin ototoksisitesine karşı koruyucu etkisini odyolojik testler ve biyokimyasal parametrelerle değerlendirmektir.

Yöntem ve Gereçler

Hayvanlar
Çalışma için 250 ila 300 gr ağırlığındaki 32 yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanı kullanıldı. Preyer refleksi pozitif olan sıçanlar seçildi ve tüm sıçanların timpanik membranları ve dış kulak kanalları 2.7 mm 0o endoskop ile incelendi. Kulak kanallarında kulak kiri bulunan ve otitis media veya timpanik membran perforasyonu belirtileri gösteren sıçanlar çalışmaya alınmadı. Tüm sıçanlar, yiyecek ve suya serbest erişime sahipti ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsü altında, kontrollü sıcaklığa (25oC) sahip bir ortamda tutuldu.

İlaçlar ve Kimyasallar
Cisplatin, Hospira'dan (50 mg / 50mL, Warwickshire, BK) elde edildi. % 0.5 karboksimetil selüloz ve % 98 naringenin Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, ABD'den elde edildi (% 98 naringenin, % 0.5 karboksimetil selüloz içinde çözülür). Ksilazin hidroklorür (Rompun), İstanbul, Bayer'den satın alındı. Ketamin hidroklorür (Ketalar) ise Eczacıbaşı, İstanbul, Türkiye' dendi.

Deneysel gruplar
32 sıçan rastgele dört gruba ayrıldı. Her grup sekiz sıçan içeriyordu:

Grup 1 (n = 8) 5 gün boyunca her gün peroral olarak (p.o) % 0.5 karboksimetil selüloz aldı.

Grup 2 (n = 8), karboksimetil selüloz uygulamasından iki gün sonra tek bir intraperitoneal doz sisplatin (16 mg / kg) aldı.

Grup 3 (n = 8) naringenin 50 mg / kg ve % 0.5 karboksimetil selüloz p.o. sisplatin enjeksiyonundan iki gün önce her gün naringenin 50 mg / kg ve % 0.5 karboksimetil selüloz p.o. aldı; 3. günde intraperitoneal tek doz sisplatin (16 mg / kg) uygulandı ve naringenin uygulaması 5. güne kadar sürdürüldü.

Grup 4 (n = 8) 5 gün boyunca her gün naringenin 50 mg / kg ve % 0.5 karboksimetil selüloz p.o. aldı.

Kullanılan naringenin dozunun ayarlanılmasında daha önce yapılan çalışmalar örnek alınmıştır (6).

Çalışmanın başlangıcında ve 6. günde, tüm sıçanlara periton içi 5 mg / kg ksilazin hidroklorür ve 40 mg / kg ketamin hidroklorür ile anestezi uygulanmıştır. Anestezi sonrası DPOAE ve ABR ölçümleri yapılmıştır. 6. günde tüm sıçanlardan biyokimyasal parametreleri hesaplamak için intrakardiyak kan örnekleri alınmıştır.

Odyolojik değerlendirme
Distorsiyon ürünü otoakustik emisyon (DPOAE)

DPOAE' leri ölçmek için Neurosoft Neuro-audio cihazı (Ivanova, Rusya) kullanılmıştır. Ölçümler sessiz bir odada yapılmıştır. En küçük boyutlu timpanometri probu dış kulak kanalına yerleştirilerek her iki kulakta ölçümler yapılmıştır. DPgram ölçümleri 988, 2222, 3200, 4444, 5000, 6154, 8000, 8889, 10000 ve 11429 Hz frekanslarında gerçekleştirilmiştir. Sinyal gürültü oranının 6 dBSPL üzerindeki DPOAE değerleri pozitif olarak kabul edilmiştir.

İşitsel beyin sapı yanıtı (ABR)
ABR ölçümleri sessiz bir odada Neurosoft Neuro-audio cihazı (Ivanova, Rusya) ile subdermal iğne elektrotları kullanılarak yapılmıştır. Alternatif polaritelerde click uyarıları sağlamak için ER-2 insert kulaklık kullanılmıştır. İşitsel uyaran olarak 21/saniye tekrar hızında 30-2000 Hz bant-pass filtreli 16 kHz'lik Tone-Burst uyarısı kullanılmıştır. Eşik, 100 dB SPL' den başlayarak, ardından eşiğe ulaşılana kadar 10 dB'lik basamaklar ile azaltılarak belirlendi. ABR eşiği beşinci dalganın gözlemlendiği en düşük yoğunluk seviyesi olarak tanımlanmıştır.

Biyokimyasal değerlendirme
Biyokimyasal analizler için sıçanlardan alınan kan örnekleri 3.000 rpm'de 15 dakika santrifüj edilmiş ve serum izole edilmiştir. Oksidatif stres, pro- ve antioksidanlar arasındaki dengenin pro-oksidanlara doğru kayması anlamına gelir [16]. Zaman ve maliyet nedeniyle farklı antioksidanları tek tek ölçmek zordur. Yakın zamanda geliştirilen toplam antioksidan durumu (TAS) ölçme yöntemi, tüm antioksidanların serumda basit bir ölçümle tek bir parametre olarak kısa sürede çok düşük bir maliyetle kaydedilmesini sağlar [17]. TAS, antioksidanların birleşik aktivitesini ve toplam antioksidan seviyesini ölçerek kapsamlı antioksidan durumunu değerlendirir. Bununla birlikte, tek bir prooksidan molekülün ölçümü için pratik yöntemler yoktur, ancak bunun yerine tek bir parametre olan toplam oksidan durumu (TOS) serumda ölçülebilir [18]. TOS, toplam oksidan seviyelerinin bir göstergesidir. Oksidatif stres indeksi (OSI) vücuttaki oksidatif stres için daha doğru bir indeks sağlar, çünkü bu oran tüm oksidan ve antioksidan aktivitelerin toplamını hesaba katar. TAS ve TOS, Rel Assay Diagnostics kiti (Mega Tip San ve Tic Ltd Sti, Gaziantep, Türkiye) ile ölçülmüştür ve OSI, TAS ve TOS'tan (OSI: TOS / TASX100) hesaplanmıştır.

İstatistiksel analiz
İstatistiksel analiz SPSS sürüm 22.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, ABD) kullanılarak yapılmıştır. Tüm nicel değişkenler merkezi konum ölçüleri (ortalama ve medyan) ve dağılım ölçüleri (standart sapma) kullanılarak hesaplanmıştır. Veri normalliği Kolmogorov-Smirnov testleri kullanılarak kontrol edilmiştir.

DPOAE ve ABR değerlerinin gruplar arası karşılaştırmaları için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır ve gruplar arasındaki farklar p <0.05' te istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek için Tukey's (HSD) post-hoc testi kullanılmıştır.

Eşleştirilmiş örnekler t-testi, DPOAE ve ABR değerlerinin grup içi karşılaştırmaları için kullanılmıştır ve grup içindeki fark p <0.05' te istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir.

Gruplar arası biyokimyasal parametrelerin değerlendirilmesinde tek yönlü ANOVA kullanılmıştır ve gruplar arası farklar p <0.05' te istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi). Gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek için Tukey's (HSD) post-hoc testi kullanılmıştır.

Bulgular

Grup 1, 3 ve 4' te çalışma başında ve 6. günde ölçülen SNR değerleri arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p> 0.05) (Şekil 1).

Şekil 1: Gruplar arası DPOAE SNR değerlerinin karşılaştırılması

Gruplar arası karşılaştırmada, başlangıç değerlerinde fark olmamasına rağmen, 6. günde 998 hariç tüm frekanslar için 2. grupta değerler anlamlı olarak daha düşüktü (p <0.008).

İşitsel beyin sapı yanıtı
Gruplar arasında ilk ABR eşiklerinde anlamlı bir fark olmamasına rağmen (p> 0.05), 6. günde grup 2'deki ABR eşikleri 1., 3. ve 4. gruplardan anlamlı olarak daha yüksekti (p <0.001). 2. grupta ABR eşikleri 6. gündeki başlangıç değerlerinden anlamlı derecede yüksekti (p <0.001). Grup 1, 3 ve 4'te ilk ABR eşik değerleri ile 6. günde elde edilenler arasında anlamlı bir fark bulunmadı (p> 0.05 ) (Tablo 1).

Tablo 1: ABR eşik değerlerinin karşılaştırılması

Biyokimyasal parametreler
TOS ve OSI değerleri grup 2'de diğer gruplara göre anlamlı olarak yüksekti (p <0,001). Grup 1, 3 ve 4'ün TOS ve OSI değerleri arasında anlamlı farklılık gözlenmedi (p> 0,05).

TAS değeri grup 3 ve 4'te grup 2'ye göre anlamlı olarak yüksekti (p = 0,001). (Tablo 2)

Tablo 2: Biyokimyasal parametrelerin karşılaştırılması

Tartışma

Sisplatin uygulanan grupta DPOAE değerlerinde azalma ve ABR eşiklerinde artış gözlemlenmiştir.

Biyokimyasal bulgular ototoksisiteyi doğrulamıştır. Naringenin + cisplatin verilen grupta DPOAE değerleri ve ABR eşiklerinin korunduğunu görülmüştür. Biyokimyasal değerlendirmede, oksidatif parametrelerin naringenin + sisplatin grubunda daha düşük ve antioksidatif parametrelerin sisplatin grubundan daha yüksek olduğu saptanmıştır. Sonuç olarak, naringeninin sisplatin kaynaklı ototoksisitede koruyucu etkisi odyolojik ve biyokimyasal değerlendirmelerle gösterilmiştir.

Sisplatin ototoksisitesinin hücresel ve moleküler mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Bununla birlikte, önceki çalışmalar ototoksisite patogenezinin altında yatan mekanizmanın oksidatif stres olabileceğini göstermiştir. Sisplatin, Corti'nin organı, stria vaskülaris, spiral ligaman ve spiral ganglionik hücrelerde aşırı serbest oksijen radikalleri üretimine ve buna bağlı koklea ve OHC' lerde oksidatif hasara yol açarak apoptoza neden olur [11]. Sisplatin, aşırı serbest oksijen radikalleri üretimi yoluyla antioksidan enzimlerin seviyesini düşürür. Serbest oksijen radikal üretimi ve antioksidatif savunma mekanizmaları arasındaki stabilite bozulduğunda, oksidatif stres meydana gelebilir ve bu da koklea hücresi hasarına veya ölümüne neden olabilir [19]. Sisplatin tedavisinin antioksidan enzimlerde (TAS gibi) bir azalmaya ve oksidatif stres ürünleri (TOS ve OSI gibi) seviyesinde bir artışa neden olabileceği iyi bilinmektedir [20,21]. Önceki çalışmalara uygun olarak, TOS ve OSI düzeylerinin grup 2'de diğer gruplara göre anlamlı olarak daha yüksek olduğunu saptanmıştır ki bu da sisplatinin serbest oksijen radikallerini artırarak oksidatif stresi artırdığını göstermektedir (Tablo 2).

Naringenin, turunçgillerden elde edilen başlıca biyoaktif flavonoid bileşiği ve güçlü bir antioksidan ajandır [1]. Antioksidan aktivitesini, serbest oksijen radikallerini süpürme ve lipid peroksidasyonunu inhibe etme gibi farklı mekanizmalarla gösterir [3,4]. Daha önce yapılmış olan çalışmalar naringeninin, GSH (glutatyon) veya SOD (süperoksit dismutaz) gibi antioksidan enzimlerin artışı nedenli oksidatif hücre hasarına karşı koruyucu bir etkiye sahip olduğunu göstermiştir [22]. Çalışmamızda grup 3 (sisplatin + naringenin) ve 4 (naringenin) antioksidan parametre TAS değerini grup 2' ye (sisplatin) göre anlamlı olarak yüksek bulduk (Tablo 2). Bu bulgu, naringeninin antioksidan aktiviteyi artırdığına dair önceki çalışmaları desteklemektedir.

Bu çalışmanın güçlü yönleri, odyolojik değerlendirmede DPOAE ve ABR testlerinin ve oksidatif stresin değerlendirilmesinde biyokimyasal parametrelerin kullanılmasıdır.

Çalışmanın sınırlılıkları içinde, farklı naringenin dozların etkinliğinin değerlendirilmemesi, gruplardaki hayvan sayısının istatistiksel olarak yeterli olsa da küçük olması ve literatürde naringenin etkinliğine ilişkin doz yanıt çalışmaları olmasına rağmen [23], naringenin etkisi için doz karşılaştırması yapılmaması sayılabilir. Çalışmamızda naringenin dozunun daha önce yayınlanmış çalışmalara göre belirlenmiş olması da araştırmamızın bir sınırlaması olabilir [6,7,22]. Ayrıca naringeninin sisplatinin antitümöral aktivitesi üzerindeki etkisini araştırmadık. Farklı dozların etkinliğini ve naringeninin sisplatinin antitümöral aktivitesi üzerindeki etkinliğini gelecek çalışmalarda değerlendirmek gerekir.

Sonuç

Kaynaklar

1) Babaei H, Sadeghpour O, Nahar L, Delazar A, Nazemiyeh H, Mansouri MR, Poursaeid N, Asnaashari S, Moghadam SB, Sarker SD. Antioxidant and vasorelaxant activities of flavonoids from Amygdalus lycioides var. horrida. Turk J Biol 2008; 32:203-208.

2) Fang F, Tang Y, Gao Z et al. A novel regulatory mechanism of naringenin through inhibition of T lymphocyte function in contact hypersensitivity suppression. Biochem Biophys Res Commun 2010; 397:163-169 [ Özet ]

3) Baumann J, Wurm G, Vonbruchhausen F. Prostaglandin synthetase inhibition by flavonoids and phenolic compounds in relation to their O2 scavenging properties. Arch Pharmacol 1980; 313:330-337. [ Özet ]

4) Younes M, Seigers CP. Mechanistic aspects of enhanced lipid peroxidation following glutathione depletion in vivo. Chem Biol Interact 1981; 84:257-266. [ Özet ]

5) Qin L, Jin L, Lu L, Lu X, Zhang C, Zhang F, Liang W. Naringenin reduces lung metastasis in a breast cancer resection model. Protein Cell 2 2011; 507-516. [ Özet ]

6) Renugadevi J, Prabu SM. Cadmium-induced hepatotoxicity in rats and the protective effect of naringenin. Exp Toxicol Pathol 2010; 62(2):171-181. [ Özet ]

7) Renugadevi J, Prabu SM Naringenin protects against cadmium induced oxidative renal dysfunction in rats. Toxicology 2009; 256:128-134 [ Özet ]

8) Kuhlmann MK, Burkhardt G, Kohler H. Insights into potential cellular mechanisms of cisplatin nephrotoxicity and their clinical application. Nephrol Dial Transplant 1997; 12(12):2478-2480 [ Özet ]

9) K. Muraki, R. Koyama, Y. Honma, S. Yagishita, T. Shukuya, R. Ohashi, F. Takahashi, K. Kido, S. Iwakami, S. Sasaki, A. Iwase, K. Takahashi, Hydration with magnesium and mannitol without furosemide prevents the nephrotoxicity induced by cisplatin and pemetrexed in patients with advanced non-small cell lung cancer. J Thorac Dis 4 2012; 562-568. [ Özet ]

10) Nagy JL, Adelstein DJ, Newman CW, Rybicki LA, Rice TW, Lavertu P. Cisplatin ototoxicity: the importance of baseline audiometry. Am J Clin Oncol 1999; 28:305-308 [ Özet ]

11) Yumusakhuylu AC, Yazici M, Sari M, Binnetoglu A, Kosemihal E, Akdas F, Sirvanci S, Yuksel M, Uneri C, Tutkun A. Protective role of resveratrol against cisplatin induced ototoxicity in guinea pigs. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2012; 76:404-408 [ Özet ]

12) Mendonca LM, da Silva Machado C, Teixeira CC, et al. Curcumin reduces cisplatin-induced neurotoxicity in NGFdifferentiated PC12 cells. Neurotoxicology 2013; 34:205-211 [ Özet ]

13) Ozkul Y, Songu M, Basoglu MS, et al. Evaluation of the protective effect of a-lipoic acid on cisplatin ototoxicity using distortion-product otoacoustic emission measurements: an experimental animal study. J Craniofac Surg 2014; 25:1515-1518 [ Özet ]

14) Huang X, Whitworth CA, Rybak LP. Ginkgo biloba extract (EGb 761) protects against cisplatin-induced ototoxicity in rats. Otol Neurotol 2007; 28:828-833 [ Özet ]

15) Koyuncu I, Kocyigit A, Gonel A, Arslan E, & Durgun M. The Protective Effect of Naringenin-Oxime on Cisplatin-Induced Toxicity in Rats. Biochemistry research international 2017; 9478958. [ Özet ]

16) Sies H, Oxidative stress: introductory remarks, in: H. Sies (Ed.), Oxidative Stress, Academic Press, London, 1985, pp. 1-8.

17) Erel O, A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new generation, more stable ABTS radical catio. Clin Biochem 2004; 37 277-285. [ Özet ]

18) Erel O, A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clin Biochem 2005; 38 1103-1111. [ Özet ]

19) Sagit M, Korkmaz F, Akcadag A, Somdas MA. Protective effect of thymoquinone against cisplatin-induced ototoxicity, Eur Arc. Otorhinolaryngol 2013; 270 2231e2237 [ Özet ]

20) Toplu Y, Parlakpinar H, Sapmaz E, Karatas E, Polat A, Kizilay A. The protective role of molsidomine on the Cisplatin-induced ototoxicity. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg 2014; 66(3):314-9. [ Özet ]

21) Kelle I, Akkoc H, Tunik S, Nergiz Y, Erdinc M, Erdinc L. Protective effects of ethyl pyruvate in cisplatin-induced nephrotoxicity. Biotechnol Biotechnol Equip 2014; 28(4):674-680. [ Özet ]

22) Wang J, Yang Z, Lin L, Zhao Z, Liu Z, Liu X. Protective effect of naringenin against lead-induced oxidative stress in rats. Biol Trace Elem Res. 2012; 146(3):354-9. [ Özet ]

23) Li P, Wang S, Guan X, Cen X, Hu C, Peng W, Wang Y, Su W. Six months chronic toxicological evaluation of naringin in Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol 2014; 66:65-75. [ Özet ]